Καλλιέργεια μανιταριών: Απομόνωση μυκήτων

Βασίλειος Καουνάς, Μέλος των Μανιταρόφιλων Ελλάδας

Γνωρίζουμε πως τα μανιτάρια είναι το αποτέλεσμα της καρποφορίας ενός μύκητα. Το σώμα του μύκητα λέγεται θαλλός και αποτελείται κυρίως από επιμήκη κύτταρα που λέγονται υφές. Οι υφές, στην πλειονότητα των περιπτώσεων, ενώνονται μεταξύ τους και σχηματίζουν μικροσκοπικά νήματα, το μυκήλιο, ένα είδος πλέγματος που μοιάζει με δίχτυ από λεπτές κλωστές ή πυκνό σύμπλεγμα από ίνες βαμβακιού. Αυτό το μυκήλιο μπορούμε να το δημιουργήσουμε και εμείς από κάποιο μανιτάρι που θα βρούμε στη φύση. Στη συνέχεια και για όσο αφορά ξυλοσυπτικά μανιτάρια μπορεί να χρησιμοποιηθεί για καλλιέργεια του μανιταριού. Αυτή η διαδικασία ονομάζεται απομόνωση μυκήτων και θα παρουσιαστεί μέσω ενός πειράματος που πραγματοποιήθηκε από τον γράφοντα.

Για να πραγματοποιηθεί μία τέτοια εργασία θα πρέπει να υπάρχει  και ο  απαραίτητος εξοπλισμός. Σε επαγγελματική και ερευνητική βάση, η όλη εργασία γίνεται σε σύγχρονα εργαστήρια, με τον κατάλληλο εξοπλισμό και την κατάλληλη ατμόσφαιρα, απαλλαγμένη από μικρόβια, μικροοργανισμούς και αιωρούμενα σπόρια άλλων παθογόνων μυκήτων. Όμως για αυτόν που θέλει να πειραματιστεί η όλη διαδικασία μπορεί να γίνει και στην κουζίνα του σπιτιού, παρόλο που δεν είναι και ο πλέον κατάλληλος χώρος. Προσωπικά προτίμησα το Pleurotus ostreatus που χαρακτηρίζεται ως επιθετικός μύκητας και βοηθά πολύ αυτό, τον αρχάριο, στην διαδικασία απομόνωσης του. Τέλος δοκιμάστηκε και η απομόνωση της Grifola frondosa, ενός πολύ δύσκολου μανιταριού για όσο αφορά την παραπάνω δοκιμασία.

Πρώτη κίνηση η προμήθεια υλικών για την Παρασκευή του PDA (Potato Dextrose Agar). Είναι το θρεπτικό υλικό πάνω στο οποίο θα δημιουργηθεί το μυκήλιο του μανιταριού. Φυσικά στο εμπόριο υπάρχει και έτοιμη σκόνη για την δημιουργία του PDA.

1^ο. Χρειαζόμαστε απιονισμένο νερό. Υπάρχει άφθονο σε όλα τα super market.

2^o. Πατάτες που χρειαζόμαστε για το εκχύλισμα, επίσης υπάρχουν άφθονες σε όλα τα μανάβικα.

3^ο. Άγαρ φυτικό, προμηθεύτηκα από κατάστημα Βιολογικών προϊόντων. Εικ. 1. γ.

4^ο. Δεξτρόζη προμηθεύτηκα από φαρμακείο. Εικ. 1. γ.

5^ο. Κωνική φιάλη 1 lt, που χρειάζεται, δεν μπόρεσα να προμηθευθώ, καθώς θα είχα και πρόβλημα στην αποστείρωση του περιεχομένου της, λόγου όγκου. Οπότε βρήκα 3 γυάλινα δοχεία των 333 ml, που χωρούσανε ακριβώς στην χύτρα που θα γίνει η αποστείρωση στο τέλος. Εικ. 1. δ.

6^ο. Πλαστικά τρυβλία petri, προμηθεύτηκα αποστειρωμένα από το διαδίκτυο από ηλεκτρονικό κατάστημα αναλώσιμων ιατρικών εργαστηρίων. Εικ. 1. α.

7^ο. Από το ίδιο κατάστημα προμηθεύτηκα και την ταινία parafilm, απαραίτητη για την σφράγιση των τρυβλίων. Εικ. 1. β.

8^ο. Το σημαντικότερο στην όλη διαδικασία είναι ένας κλοβός (Glove box), Εικ. 1. ε.,  στο εσωτερικό του οποίου θα υπάρχουν, όσο αυτό είναι δυνατόν, αποστειρωμένες συνθήκες για να γίνει το εν λόγο πείραμα. Η μεταφορά του PDA υλικού στα τρυβλία και η μεταφορά του ζωντανού ιστού του μανιταριού, στα τρυβλία με το PDA υλικό. Ο εν λόγο κλοβός είναι πολύ ακριβός για κάποιον που δεν θέλει να ασχοληθεί επαγγελματικά. Έτσι αυτοσχεδίασα και δημιούργησα έναν μικρό πλαστικό κλοβό, μόνος μου. Αγοράζοντας ένα διαφανές, πλαστικό, μεγάλο κουτί αποθήκευσης ρούχων, έκανα δύο κυκλικές τομές στη μία του πλευρά, πέρασα δύο πλαστικούς σωλήνες, διατομής τέτοιας που να περνάει το χέρι μου. Στις εσωτερικές του πλευρές πέρασα δύο μεγάλα πλαστικά γάντια. Τα σημεία επαφής του κλοβού και των στρόγγυλων πλαστικών κολλήθηκαν με σιλικόνη για την καλύτερη ευστάθεια του κλοβού αλλά και για να μην υπάρχει δίοδος αέρα.

9^ο. Άλλα υλικά που χρησιμοποίησα, είναι ένα καμινέτο. Όταν είναι αναμμένο ο ζεστός αέρας διώχνει τα μικροσωματίδια που υπάρχουν στον αέρα και έτσι μειώνουμε τις πιθανότητες κάποιο σπόριο παθογόνου μύκητα να καθίσει πάνω στο θρεπτικό υλικό όταν γίνεται η μεταφορά του στο τρυβλίο. Ένα μπουκάλι καθαρό οινόπνευμα για την απολύμανση των χεριών μου, μία μεταλλική λαβίδα και μια χύτρα μαγειρέματος.

1^ο Στάδιο. Παραγωγή PDA (Potato Dextrose Agar)

Για 1 λίτρο PDA: Σε μια κατσαρόλα που περιέχει 500 ml απιονισμένο νερό, προστίθενται 200 g πατάτας που έχει κοπεί σε κύβους. Βράζουν σε μικρή ένταση για 45 min. Αφού βράσει το σουρώνουμε (κρατάμε το εκχύλισμα και πετάμε την πατάτα) και προσθέτουμε 20 gr άγαρ και 20 gr δεξτρόζης. Αναδεύεται καλά, ογκομετρείται το τελικό διάλυμα και προστίθεται απιονισμένο νερό μέχρι τελικό όγκο 1 λίτρου. Βάζουμε το υλικό στις τρεις γυάλινες φιάλες των 333 ml έκαστη (ο όγκος της γυάλινης φιάλης δεν έχει σχέση, αρκεί να χωράει στην χύτρα για την αποστείρωση), Εικ. 1. δ., σφραγίζονται, τυλίγουμε τα πώματα και με ένα κομμάτι αλουμινόχαρτο και ακολουθεί αποστείρωση σε χύτρα μαγειρέματος, στους 120 °C για 20 min, αφού έχει προστεθεί νερό 2-3 εκ. στην χύτρα.

2^ο Στάδιο. Μεταφορά του θρεπτικού υλικού PDA στα τρυβλία.

Ανοίγουμε τον κλοβό και τοποθετούμε τα τρυβλία μας. Στην συνέχεια αφού τελειώσει η αποστείρωση και ελαφρώς κρυώσει το υλικό στα γυάλινα δοχεία (δεν θα μπορούμε να δουλέψουμε αμέσως με τα δοχεία, λόγο της μεγάλης θερμοκρασίας που θα έχουν), τα τοποθετούμε επίσης στον κλοβό. Σφραγίζουμε με το καπάκι και ξεκινάμε την εργασία από το πλάι που έχουμε εισόδους για τα χέρια μας. Τα χέρια μας μπαίνουν μέσα στα γάντια. Αρχικά βγάζουμε το αλουμινόχαρτο και στη συνέχεια το πώμα. Γεμίζουμε τα τρυβλία με υλικό που φθάνει σε πάχος τα 3-4 χιλ. και αμέσως τα σκεπάζουμε. Αφού γεμίσουμε όλα τα τρυβλία στη συνέχεια τα σφραγίζουμε με parafilm για να μην περάσει μέσα στο υλικό κάποιος παθογόνος οργανισμός, Εικ. 1. ζ.. Μπορούμε να τα αφήσουμε εκτός ψυγείου για 4-5 μέρες. Είναι ένα αρκετό διάστημα για την ανάπτυξη παθογόνων μυκήτων ή βακτηρίων που θα δημιουργηθούν από τα τυχόν λάθη που κάναμε. Στη συνέχεια μπορούμε να τα διατηρήσουμε στο ψυγείο για αρκετό διάστημα.

3^ο Στάδιο. Μεταφορά ιστού στο τρυβλίο με το PDA.

Όπως σας είπα, το πείραμα ξεκίνησε με το Pleurotus ostreatus. Χρησιμοποιήθηκε στέλεχος από το εμπόριο. Αρχικά μπήκαν τα τρυβλία στον κλοβό και τους αφαιρέθηκε το parafilm. Στην συνέχεια επιλέχθηκε από ένα σφριγηλό καρπόσωμα πλευρωτού ο στύπος και απολυμάνθηκε με καθαρό οινόπνευμα. Βάζουμε και αυτό το τμήμα στο κλοβό και τον σφραγίζουμε. Με τα γάντια μας πλέον σκίζουμε τον στύπο χωρίς να έρθει σε επαφή η σάρκα του εσωτερικού του στύπου με καμία επιφάνεια. Με την λαβίδα παίρνω ένα τμήμα του εσωτερικού ιστού και το τοποθετώ στο τρυβλίο, αυτή την διαδικασία την επαναλαμβάνω για όσα τρυβλία θέλω να ετοιμάσω. Στη συνέχεια τα τρυβλία σφραγίζονται πάλι με parafilm. Αποθηκεύονται για λίγες μέρες εκτός ψυγείου για να δούμε μήπως και κάποιος άλλος μικροοργανισμός έχει περάσει. Μετά από λίγες μέρες θα γίνουν ορατές οι πρώτες μυκιλιακές υφές, αυτές που θα δημιουργήσουν το μυκήλιο του μύκητα. Στη συνέχεια τα τρυβλία με τα μυκήλια μπορούν να τοποθετηθούν στο ψυγείο.

Από την όλη διαδικασία συμπέρανα πως δεν είναι κάτι εύκολο αλλά όχι και ακατόρθωτο. Για τον πλευρωτό δημιούργησα 10 τρυβλία, από τα οποία έδωσαν μυκήλιο τα 5, μέσα σε 10 μέρες περίπου, Εικ. 1. η.. Δείγμα του πόσο εύκολο είναι να πειραματιστεί ένας αρχάριος με αυτό το επιθετικό μανιτάρι. Ενώ για την γριφίσκη, χρησιμοποιήθηκε αυτοφυές στέλεχος από την Ζαγορά Πηλίου. Από τα 10 τρυβλία, έδωσε μυκήλιο μόλις το 1, σε διάστημα 1 μηνός, Εικ. 1. ι.. Δύο μανιτάρια με εντελώς διαφορετική συμπεριφορά. Μάλιστα δοκίμασα να καλλιεργήσω πλευρωτό σε χαρτί υγείας. Σε βρεγμένο χαρτί υγείας, έβαλα τμήμα μυκηλίου του πλευρωτού και μετά από αρκετό διάστημα έκανε την εμφάνιση του το πρώτο καρπόσωμα, δυστυχώς δεν μεγάλωσε πολύ, λόγο έλλειψης κυτταρίνης, απαραίτητου υλικού για την ανάπτυξη του, Εικ. 1. θ..

Μετά από αυτή την διαδικασία έχουμε έτοιμο υλικό για να περάσουμε στην επόμενη φάση, που λέγεται grain spawn και είναι η μεταφορά του μυκηλίου σε σπόρους δημητριακών.